 |
|
|
|
單位：南京億迅生物科技有限公司
聯(lián)系人：劉女士
電話：13047500758
傳真：
手機：13047500758
郵箱：196099363@qq.com
|
|
|
|
|
 |
|
|
| |
蛋白表達常見問題分析
|
|
發(fā)布日期：[2017/2/28 15:16:56] 共閱[12252]次 |
影響蛋白表達有許多因素，如目的蛋白自身的特點，表達載體、表達菌株的組合，誘導(dǎo)表達的條件，培養(yǎng)基的選擇等，都有可能對蛋白的表達產(chǎn)生影響。針對蛋白表達中的一些常見問題，可嘗試用如下方法加以解決。
一、蛋白不表達或表達量很低
1.選擇正確的表達載體與表達菌株
基于T7 啟動子的載體(如pET 系列載體)應(yīng)選用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3) 等菌株不是基于T7 啟動子的表達載體(如帶有tac 啟動子的pGEX、pMal 系列表達載體)應(yīng)選用BL21 表達菌株。
對細胞有毒性的蛋白，應(yīng)該選用背景表達低、嚴緊調(diào)控誘導(dǎo)的菌株，如BL21(DE3)pLysS 菌株。 對于帶有稀有密碼子的蛋白或來源于真核基因的蛋白，應(yīng)該選用Rosetta(DE3) 等菌株。
2.嘗試不同的表達系統(tǒng)與菌株
不同的蛋白，對不同載體與菌株的偏好不同，如果某一表達系統(tǒng)無法通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件得到明顯改善，可以更換其它的菌株或表達載體。
3.表達條件的優(yōu)化
選擇不同的培養(yǎng)基。對于某些蛋白，在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖(0.1%~0.5%)，可以明顯提高表達量。
較高的溫度、較高的誘導(dǎo)物濃度、較長的表達時間，一般可以加快表達的速度，促進目的蛋白的積累，從而提高表達量。但是可能會降低可溶蛋白的表達量，形成包涵體。
菌體的生長狀態(tài)對蛋白表達有很大的影響，可以通過測量菌液的OD 值監(jiān)測生長狀態(tài)。對于大部分蛋白，應(yīng)在菌液的對數(shù)生長期(OD ≈ 0.5)進行誘導(dǎo)。
二、目的蛋白不可溶，形成包涵體
首先確認目的蛋白是否有表達。裂解菌體并離心后，通過對全菌、上清、沉淀的檢測，確認目的蛋白是否表達，還是形成了包涵體。
包涵體的形成與蛋白自身結(jié)構(gòu)、表達系統(tǒng)、誘導(dǎo)表達條件等因素有著密切關(guān)系。在無法改變蛋白自身結(jié)構(gòu)的情況下，可以嘗試不同的表達系統(tǒng)與菌株，增強其溶解能力，優(yōu)化出適合特定蛋白的表達系統(tǒng)。
目前認為包涵體的形成是基于蛋白在菌體內(nèi)積累速度過快，沒有正確折疊而聚集沉淀�？梢酝ㄟ^優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件，減緩蛋白的積累。如：降低誘導(dǎo)溫度、降低誘導(dǎo)物濃度、縮短表達時間、降低誘導(dǎo)時菌液的OD 值。原創(chuàng)作者：南京億迅生物科技有限公司 |
|
|
總訪問量：3851360 管理登陸 版權(quán)所有:南京億迅生物科技有限公司
