蛋白酶 K簡介從林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中純化得到。據(jù)資料顯示：該酶有兩個ca2+結(jié)合位點，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機理并無直接關(guān)系。然而，如果從該酶中除去ca2+，由于出現(xiàn)遠程的結(jié)構(gòu)變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染酸制品的蛋白質(zhì)。所以，蛋白酶k消化過程中通常加入edta（以抑制依賴于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化對蛋白酶k具有較強耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/l ca2+而不含edta的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至終濃度為2mmol/l,以鰲合ca2+。
蛋白酶K，是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。此酶經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力，因而它應(yīng)用很廣泛，包括制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml。在較廣的pH范圍內(nèi)（pH 4-12.5）均有活性。
推薦反應(yīng)緩沖液：50mMTris-HCl(pH7.5),10mM CaCl2 。
蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)：20mg/ml蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)（proteinase K）：將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。
蛋白酶 K作用
值得注意的是，蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的處理,它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用,以增加探針與靶核酸結(jié)合的機會,提高雜交信號.但蛋白酶K的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高時,都會對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞,導(dǎo)致組織切片的脫落,細(xì)胞核的消失,從而影響雜交結(jié)果.EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用,解決上述出現(xiàn)的問題,并能達到理想的染色效果.
蛋白酶 K保存方法
保存：保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，有效保證12月。
孵育溫度為55至65℃，理想孵育溫度為58℃，孵育時間為15分鐘至48小時；理想孵育時間為2小時。
蛋白酶 K應(yīng)用
蛋白酶K已廣泛應(yīng)用在皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、釀造等方面。皮革工業(yè)的脫毛和軟化已大量利用蛋白酶，既節(jié)省時間，又改善勞動衛(wèi)生條件。蛋白酶還可用于蠶絲脫膠、肉類嫩化、酒類澄清。臨床上可作藥用，如用胃蛋白酶治療消化不良，用酸性蛋白酶治療支氣管炎，用彈性蛋白酶治療脈管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶對外科化膿性創(chuàng)口的凈化及胸腔間漿膜粘連的治療。加酶洗衣粉是洗滌劑中的新產(chǎn)品，含堿性蛋白酶，能去除衣物上的蛋白污物，但使用時注意不要接觸皮膚，以免損傷皮膚表面的蛋白質(zhì)，引起皮疹、濕疹等過敏現(xiàn)象。
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