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您知道Western Blot實驗的操作技能嗎？
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發(fā)布日期：[2024/5/27 17:10:27] 共閱[3407]次 |
您知道Western Blot實驗的操作技能嗎？
免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質(zhì)印跡（Western blotting），是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測，可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異。
一，蛋白提取
1. 細胞樣品在提取需要使用PBS清洗兩遍，以減少培養(yǎng)基對樣品的干擾，懸浮細胞可500Xg低速離心后收集進行蛋白提取。貼壁細胞可在培養(yǎng)器皿中直接進行蛋白提取。蛋白提取建議進行細胞計數(shù)，以確定提取中添加裂解液的比例，得到提取效率。
2. 組織樣品在提取也需要用PBS清洗，一些含血量豐富的組織，建議使用紅細胞裂解液去除紅細胞，以避免血液中IgG對后續(xù)實驗的影響。
3. 為了防止蛋白降解、去磷酸化，各種蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑都是必須的。
4. 在提取蛋白的時候僅僅靠裂解液有時候也不能達到抽提的效果，有條件的話，可以對抽提懸液進行超聲破碎處理；超聲的時候，因為超聲發(fā)熱損傷蛋白，需要把要超聲的樣本放到冰水混合物里。
5. 此外如果沒有裂解buffer，可以用1×SDSloading buffer代替來抽提蛋白，其效果類似于SDS裂解液，不過抽提后的樣本不能進行濃度測定。
6. 蛋白煮沸變性一般是95-100°C，5-10min，水浴鍋煮沸時，可用帶夾EP管防止EP管蓋彈開，使水浴鍋內(nèi)的水進入而使樣品廢掉。 二、蛋白電泳
正確選擇凝膠濃度與電泳條件能夠讓目的蛋白區(qū)域限度的分離開，從而使條帶的位置，雜帶位置等一些因素的影響降低。
采用SDS-PAGE電泳，每孔上樣等體積總蛋白，上樣時，先加marker，如有空置的加樣孔，須加等體積的1×loading buffer，以防相鄰泳道樣品的擴散。開始電壓為80V，使樣品跑得慢一些，充分濃縮，到達分離膠后調(diào)為120V，電泳至溴酚藍要跑出即可終止電泳。關(guān)于電泳液，建議新鮮配制，也可先配10x的，然后現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。Tips：蛋白電泳玻璃板清洗后，為了使表面的水快速晾干，可以在烘箱中放置幾分鐘，拿出來的時候后需平衡至室溫再灌膠，不然很容易產(chǎn)生氣泡配膠用的試劑一般都是在4度冰箱保存，當我們按比例配好混合液的時候，要等混合液恢復(fù)室溫時，再灌膠，不然也很容易產(chǎn)生氣泡玻加水液封時，速度要慢，可用1ml*沿著膠板上沿反復(fù)移動，不然很容易將分離膠沖變形梳子注意和玻璃板匹配，1.5mm的梳子很難插進1mm的玻璃板中，暴力插入會破壞膠板；如果1mm的梳子插到了1.5mm的玻璃板中，由于中間有空隙，就會有膠凝固在里面濃縮膠凝好可以泡到電泳緩沖液里，比較容易拔出。
三、蛋白轉(zhuǎn)膜/膜的選擇
1.現(xiàn)在用的多的是PVDF膜，用之需注意：
①先在純甲醇中浸濕膜15s，使PVDF膜充分活化；
②將膜放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡至少5min2.C膜不需要甲醇活化。
四、膜的孔徑
1.根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的印跡膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固
2.通常用0.45μm和0.2μm兩種規(guī)格的印跡膜。大于20KD的蛋白可用0.45μm 的膜，小于20KD的蛋白就要用0.2μm的膜
五、小分子蛋白
1.小分子蛋白很容易轉(zhuǎn)過，所以摸索適合自己蛋白的轉(zhuǎn)膜條件很重要，這一步很難說一次就成功，所以剛開始的時候可以在接觸膠面的PVDF膜上再放一張PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，立春紅染色，觀察使用的條件是否會轉(zhuǎn)過頭
2.小分子蛋白轉(zhuǎn)膜液中一定不要加SDS，因為SDS會影響轉(zhuǎn)膜效果
3.小分子蛋白濕轉(zhuǎn)參考100V恒壓，或者150-200恒流，40-60min，都可以跑出來結(jié)果，同時也可以使內(nèi)參的效果很好
4.小分子蛋白轉(zhuǎn)膜液甲醇濃度為20%
5.分子量小于10 kDa的多肽或蛋白，建議使用Tricine-SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)。
六、大分子蛋白
1.轉(zhuǎn)膜時間要適當延長，220V，300mA，濕轉(zhuǎn)，建議時間在2h30min-3h，因為轉(zhuǎn)膜時間很長，可以預(yù)冷轉(zhuǎn)膜緩沖液，同時提準備好足夠的冰袋降溫2.轉(zhuǎn)膜液中可以加入適量SDS（濃度0.1%），對于大分子量蛋白加入SDS是為了增加了蛋白表面電荷，從而增加轉(zhuǎn)膜效率3.大分子蛋白轉(zhuǎn)膜液甲醇濃度為5%七、印跡膜封閉1.脫脂奶是常用的經(jīng)濟配方。
2.脫脂奶粉不能與生物素化的抗體一起使用，因為脫脂奶粉含有糖蛋白和生物素；建議使用BSA。
3.分析磷酸化蛋白須用BSA。脫脂奶粉含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因為磷酸酶與膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化;也不適用于堿性磷酸酶(AP)檢測系統(tǒng)。
4.如果用辣根過氧化物酶(HRP)檢測系統(tǒng)，封閉液不應(yīng)加疊氮鈉(NaN3)，因為疊氮鈉對辣根過氧化物酶（HRP）有滅活作用。
5.如果用二抗抗體是堿性磷酸酶(AP)標記的檢測系統(tǒng)，可使用酪蛋白封閉，同時須選擇TBS緩沖溶液，不可使用PBS緩沖溶液，因為PBS緩沖溶液干擾堿性磷酸酶。
七、一抗二抗孵育
1.建議孵育抗體定要仔細看抗體說明書，了解抗體的種屬來源和抗體的建議稀釋比例。2.選擇二抗抗體取決于一抗抗體的動物來源。例如,如果一抗抗體是小鼠來源單克隆抗體,二抗抗體必須是抗小鼠的抗體；如果一抗抗體是兔來源多克隆抗體,二抗抗體必須是抗兔的抗體。3.建議使用商品化的抗體稀釋液稀釋一抗二抗，不僅能有效減少一抗或二抗的非特異性結(jié)合，并有效提升稀釋后抗體的穩(wěn)定保存時間，可重復(fù)利用。
八、顯影成像
1.建議使用高信號強度、高靈敏度、高穩(wěn)定性的ECL化學(xué)發(fā)光試劑。
2.顯影液務(wù)必覆蓋整個印跡膜。
3.顯影液A液和B液吸取過程中必須更換移液器*頭，避免相互污染失效。
4.ECL工作液需避免強氧化劑如次氯酸鈉等對工作液的影響。
5.須確保試劑瓶干凈，無微生物或其它試劑污染。為了小伙伴們的安全，請穿實驗服并佩戴一次性手套。
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