1.SDS-PAGE試劑:見(jiàn)電泳實(shí)驗(yàn)。

2.勻漿緩沖液:1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml;10%SDS 6.0ml;β-巰基乙醇 0.2ml;ddH2O 2.8ml。

3.轉(zhuǎn)膜緩沖液:甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。

4.0.01M PBS(pH7.4):NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml。

5.膜染色液:考馬斯亮蘭 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脫脂奶粉，現(xiàn)配):脫脂奶粉1.0g 溶于20ml0.01M PBS中。

6.顯色液:DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸鎳胺 0.1ml;H202 1.0μl。

1.單層貼壁細(xì)胞總蛋白提取:

(1)倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液(或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。

(2)每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

(3)按1ml裂解液加10 μl PMSF(100mM)，搖勻置于冰上。(PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。)

(4 )每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。

(5 )裂解完后，用干凈刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶一側(cè)(動(dòng)作要快)，然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。(整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。)

(6 )于4℃下12000rpm離心5min。(提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷)

(7 )將離心后上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5ml離心管中放于-20℃保存。

2. 組織中總蛋白提取:

(1 )將少量組織塊置于1~2ml勻漿器中球狀部位，用干凈剪刀將組織塊盡量剪碎。

(2)加400 μL單去污劑裂解液裂(含PMSF)于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。

(3 )幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。

(4) 裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。

3. 加藥物處理貼壁細(xì)胞總蛋白提取:

由于受藥物影響，一些細(xì)胞脫落下來(lái)，所以除按(一)操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白提取:

(1 )將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。

(2 )棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。

(3)用槍洗干上清后，加100 μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30min，裂解過(guò)程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。

(4)將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。