免疫組化實驗檢測

億迅億迅生物科技有限公司具有專業(yè)生物實驗室，10年以上操作經(jīng)驗資深技術人員，能夠?qū)�業(yè)、高效進行免疫組化實驗操作。

實驗技術簡介：免疫組化是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合原理，通過化學反應使標記抗體顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。

免疫組化（IHC）技術通過計分法或灰度計量法也可以反應抗原表達量，但其特點在于切片制作過程中保持組織、細胞原有結構及形態(tài)，因此可以反應目標抗原在組織結構中分布以及亞細胞定位。組織細胞定位往往是生理功能發(fā)揮或變化體現(xiàn)，是研究中常常關注因素。

免疫組化主要步驟:
1.洗載玻片: 將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目是為了是載玻片上硅膠等除去,同時使一些肉眼看不見凹凸不平表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中，將多聚賴氨酸涂布于玻片表面，由于Lys帶正電，而大多數(shù)組織帶負電荷，從而產(chǎn)生吸附作用。
2.包埋組織: 先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，*后加入少許液體石蠟，進行冷凍，使石蠟變成固態(tài)。
3.切片：將包埋好組織從模具上取下來，并置于石蠟切片機上，切片機通過調(diào)節(jié)上下左右來來使組織和切割方向一致，然后調(diào)節(jié)切片厚度，一般為5µm,如果比較難切，則可以適當調(diào)整厚度，用毛筆將切割載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織載玻片置于40°C溫水中。
4.撈組織：當組織載玻片置于40°C溫水中之前，要先將水浴中氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開，是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時，一般取載玻片下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對照使用，這樣形成誤差就比較小了，而且撈載玻片時候方向一致，以便觀察，再將撈出來載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干。
5.脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用主要是二甲苯,依據(jù)是相似相溶原理.一般在每個試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷話,就要適當延長脫蠟時間,一般為12-15min.
6.抗原修復：脫蠟后在清水中沖洗一段時間，加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內(nèi)源性過氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮目是為了使抗原位點暴露出來。
7.血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周圍PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性位點封閉起來，然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。
8.加一抗：將溫箱中載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍血清，加一抗，如果做對照實驗，就在對照組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜。

免疫組化實驗檢測

9.加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍PBS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時。
10.加SABC: 將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
11.加顯色劑: 將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍PBS后加上顯色劑。（顯色劑配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）   A：DAB        B：H2O2        C：磷酸緩沖液
12.復染: 將顯色后片子用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動物組織為半分鐘，植物組織3-5min。
13.脫水：將復染后片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min，*后浸泡在二甲苯中，搬到通風柜中。
14.封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側，然后輕輕放下另一側，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風柜中晾干。
免疫組化相關試劑：*重要是選擇好一抗、二抗或者還有三抗，注意抗體特異性、效價和交叉反應。

【應用范圍】

1.病理診斷，如惡性腫瘤診斷和分型； 
2. 觀察并比較組織內(nèi)目蛋白分布情況；
3. 觀察并分析不同組織間目蛋白表達和分布差異化； 
4. 比較和分析目蛋白在組織內(nèi)相對表達量；
5. 組織內(nèi)目蛋白定性研究；
6. 組織形態(tài)觀察等。

【實驗保證】 

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3. 期刊圖像水準；

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1. 新鮮組織塊

2. 固定組織塊

3. 石蠟組織或切片等等

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